LAPORAN
LENGKAP
PRAKTIKUM
KIMIA ORGANIK
PERCOBAAN HPLC
OLEH :
FARMASI B
NAMA : RESKI AMELIA HUSAIN
ANGKATAN 2015
LABORATORIUM
KIMIA ANALISA
JURUSAN
FARMASI
FAKULTAS
KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGRI ALAUDDIN MAKASSAR
SAMATA-GOWA
2016
BAB I
PENDAHULUAN
A.
Latar belakang
Biasanya zat murni telah tercemar dengan zat-zat lain
yang dapat membentuk campuran yang bersifat homogen dan heterogen yang
bergantung pada jenis komponen yang tergantung didalamnya. Zat murni ada
dua yaitu unsur dan senyawa, sedangkan campuran merupakan gabungan dua zat
murni dengan komposisi sembarangan. Zat murni yang telah tercemar mengandung
zat-zat lain dalam bentuk gas, cair, atau padatan.
Dibumi jarang terdapat materi dalam keadaan murni,
melainkan dalam bentuk campuran. Contohnya, air laut terdiri dari iar dan
berbagai zat yang tercampur didalamnya, misalnya garam. Tanah terdiri dari
berbagai senyawa dan unsur baik dalam wujud padat, cair, atau gas. Udara yang
kita hirup setiap hari mengandung bermacam-macam unsur dan senyawa, seperti
oksigen, nitrogen, uap air, karbon monoksida, dan sebagainya.
Untuk memperoleh zat murni kita harus memisahkannya dari
bahan-bahan pencemar atau pencampuran lainnya pada suatu campuran dengan sistem
pemisahan dan pemurnian. Banyak cara atau teknik yang dilakukan dalam pemisahan
campuran. Hal tersebut bergantung pada jenis, wujud, dan sifat komponen yang
terkandung didalamnya, seperti pemisahan pemisahan zat padat dari suspensi,
pemisahan zat padat dari larutan, pemisahan campuran zat cair, pemisahan
campuran dua jenis padatan.
Pada prinsipnya pemisahan dilakukan untuk memisahkan dua
zat atau lebih yang saling bercampur dan pemurnian dilakukan untuk mendapatkan
zat murni dari suatu zat yang telah tercemar oleh zat lain.
B. Maksud
dan tujuan
1.
Maksud Percobaan
Maksud dari percobaan ini adalah untuk
mengetahui dan memahami mettode analisis dengan menggunakan KCKT
2.
Tujuan
percobaan
a.
Memahapi
cara insttrumen HPLC untuk analisis kuantitatif
b.
Dapat
melakukan preparasi dengan tpat dan akurat , serta dapat mengikuti manual
pengoprasian HPLC
c.
Dapat
menentukan/menghitung kadar senyawa dalam sampel
C.
Prinsip Percobaan
Pinsip percobaan
ini adalah analisis senyawa dari sample berdasarkan tingkat kepolaran yang
terdistribusikan pada fase diam dan fase gerak.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Teori Umum
Kromatografi
adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk memisahkan
komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam kromatografi,
campuran tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada salah satu ujung
media porus seperti adsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi.
Zona campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan atau gas yang
bergerak sebagai pembawa, melaui media porus tersebut, yang berupa
partikel-partikel yang ”diam“ (tidak bergerak, statisiones). Sehingga akibatnya
masing-masing komponen dari campuran tersebut akan terbagi (terdistribusi)
secara tidak merata antara alas yang “diam” dan cairan atau gas yang
membawanya. Akibat selanjutnya, masing-masing komponen akan bergerak
(bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential migration) dan dengan
demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut pada waktu yang
berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponen-komponen
yang ada. (Bahti, Husein H. 2011: 4).
Banyaknya
macam-macam kromatografi yang salah satunya adalah kromatografi gas, yang
merupaka metode kromatografi pertama yang dikembangkan pada zaman instrumen dan
elektronika. Kromatografi gas dapat dipakai untuk setiap campuran dimana semua
komponennya mempunyai tekanan uap yang berarti, suhu tekanan uap yang dipakai
untuk proses pemisahan. Tekanan uap atau keatsirian memungkinkan komponen
menguap dan bergerak bersama-sama dengan fase gerak yang berupa gas (Acun, dkk,
2010:205).
Kromatografi
merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran yang
berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen sampel diantara dua
fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi yang
dimana fasa gerak dan fasa diamnya menggunakan zat cair adalah HPLC (High
Performance Liquid Chromatography) atau didalam bahasa Indonesia disebut KCKT
(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).
Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair,
yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis
kuantitatif. Analisis kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran
luas area standar. Pada prakteknya, metode pembandingan area standar dan sampel
kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan suatu konsentrasi
standar. Oleh karena itu, dilakukan dengan
menggunakan teknik kurva kalibrasi. (Wiji, dkk. 2010 : 17).
HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan dari
kebutuhan, keinginan manusia untuk meminimalis pekerjaan, kemampuan teknologi,
dan teori untuk memandu pengembangan pada jalur yang rasional. Jelas sebelum
era peralatan yang modern bahwa LC (Liquid Chromatography) memiliki kekuatan
pemisahan yang sangat ampuh, bahkan untuk komponen-komponen yang berhubungan
sangat erat. LC harus ditingkatkan kecepatannya, diotomasasi, dan harus
disesuaikan dengan sampel-sampel yang lebih kecil, waktu elusi yang beberapa
jam (Underwood, Day. 2002 : 553).
HPLC berbeda dari kromatografi kolom cairan konvensional
dalam hal digunakan bahan pengisi kolom berupa partikel yang sangat kecil
berukuran sampai 3-5 μm (1μm = 10-6 m). Sehingga mengharuskan
digunakannya tekanan tinggi sampai 20.000 Kpa (
200 atmosfir) untuk mengalirkan fasa gerak melalui kolom tersebut.
Ternyata, penggunaan bahan pengisi kolom yang lebih kecil
ini bukan saja telah memperbaiki
kecepatan analisis, tapi (dari ini yang lebih penting) ialah telah menghasilkan
suatu teknik dengan daya pisah yang tinggi. HPLC mempunyai kelemahan- kelemahan
yang diantaranya, peralatannya lebih rumit, tidak murah, dan perlu pengalaman.
Untuk beberapa jenis zat, metode ini kurang sensitif. Selain itu sampel
disyaratkan harus stabil dalam larutan.
Berdasarkan kepolaran fasa geraknya, HPLC dibagi menjadi 2
macam yaitu :
Fase
Normal HPLC
HPLC jenis ini secara esensial sama
dengan kromatografi kolom. Meskipun disebut normal, ini bukan bentuk biasa dari
HPLC. Kolom ini diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut
nonpolar seperti heksan sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6
mm (dan kemungkinan kurang dari nilai ini) dengan panjang 120 nm-250 nm.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada
silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu,
senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Apabila
pasangan fasa diam lebih polar daripada fasa geraknya maka sistem ini disebut
HPLC fase normal.
Fase
Balik HPLC
Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya
sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan
hidrokarbon dengna rantai panjang pada permukaannya secara sederhana baik
berupa atom karbon 8 atau 18. Dalam kasus ini, akan terdapat interaksi yang
kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom.
Interaksi yang terjadi tidak sekuat interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon
yang berlekatan pada silika (fasa diam) dan molekul-molekul polar dalam
larutan. Oleh karena itu molekul-molekul polar akan lebih cepat bergerak
melalui kolom(Underwood, Day. 2002 : 556-558).
Prinsip
dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap
komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan
dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif).
Analisa kualitatif bertujuan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia
dari analat dalam suatu sample. Sedangkan analisa kuantitaif untuk mengetahui
jumlah dan konsentrasi analat tersebut dalam sample (Riyadi, 2009:302).
B.
Uraian Bahan
1.
Aquades
(Dirjen POM.1979:96)
Nama Resmi : AQUA DESTILLATA
Nama Lain : Air suling, Air destilasi, Aqua depurate
Rumus Molekul :
H2O
Rumus Struktur : H—O—H
Berat Molekul : 18,02
Pemerian
: Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau, tidak
mempunyai rasa
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
Kegunaan : Sebagai
blanko
2.
Methanol
(Ditjen POM edisi III 1979 : 706)
Nama
Resmi : METANOL
Nama
lain : Metanol
Berat
molekul : 34,00
Rumus
Struktur : CH3-OH
Pemerian : Cairan tidak berwarna,
gliserin, bau khas
Kelarutan
: Dapat bercampur dengan air,
membentuk cairan jernih tidak berwarna
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup
Kegunaan
:
Sebagai pereaksi
3.
Parasetamol (Dirjen POM, 1979).
Nama resmi
:
ACETAMINOPHENUM
Nama lain :
Acetamiofen,parasetamol
Berat
molekul :
151,16
Rumus
struktur :
Kelarutan :Larut dalam 70 bagian air, dalam 7
bagian etanol (95%),dalam 13 bagian aseton, dalam 40 bagian gliserol dan
dalam 9 bagian propilenglikol; larut dalam larutan alkali hidroksida
Pemerian :Hablur atau serbuk hablur putih,
tidak berbau, rasa pahit
Penyimpanan :Dalam wadah tertutup baik, terlindung
dari cahaya
Kegunaan : sebagai sampel
BAB III
METODE KERJA
A.
Alat
dan bahan
1. Alat
Adapun
alat yang digunakan pada percobaan kali ini adalah gelas kimia,gelas ukur,
kertas perkamen, perangkat HPLC, pipet tetes, sendok tanduk,timbangan
analitik,dan spoit.
2. Bahan
Adapun
bahan yang digunakan pada percobaan kali ini adalah aquades,methanol dan
paracetamol.
B.
Prosedur kerja
1. Pembuatan larutan sampel
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Ditimbang paracetamol sebanyak 5 mg
c. Dilarutkan menggunakan alkohol
sebanyak 10 ml
d. Diambil larutan paracetamol
menggunakan spoit secukupnya
2. Penyiapan instrument KCKT
a. Dikondisikan instrument KCKT dengan
fase gerak dengan system elusi gradien dengan kondisi
Kolom : C-18 (12,5 cm)
Panjang
gelombang : 254 nm
Laju air : 0,75 ml/menit
Volume
injeksi : 20 l
b. Dipastikan kabel penghubung listrik
telah tersambung dengan benar
c. Ditekan tombol “ON” pada saklar
listrik
d. Diisi botol fase gerak dengan volume
yang memadai dan dikosongkan botol penampung
e. Ditekan tombol “ON” pada alat
berturut-turut untuk power, detector, dan pompa
f. Dilakukan pemprograman alat untuk
computer diikuti langkahnya sesuai instruksi dari computer
g. Dipilih mode yang akan digunakan
sesuai parameter kondisi instrumen
h. Apabila kromatogram telah
menunjukkan base line yang mendatar maka instrumen siap digunakan
i.
Diinjeksikan
berturut-turut larutan standar (dimulai dari konsentrasi terendah) dan terakhir
larutan sampel
j.
Dicetak
hasil pengukuran dicatat kondisi percobaan
k. Setelah selesai digunakan dimatikan
pompa dengan menyoroti tanda pompa dalam computer
l.
Ditutup
file sesuai petunjuk lalu dimatikan computer
m. Untuk mematikan ditekan tombol ”OFF”
pada pompa, detector, dan power secara berurutan diputuskan sambungan listrik
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A.
Tabel Pengamatan
B.
Pembahasan
Kromatografi
adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk memisahkan
komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam kromatografi,
campuran tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada salah satu ujung
media porus seperti adsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi.
Zona campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan atau gas yang
bergerak sebagai pembawa, melaui media porus tersebut, yang berupa
partikel-partikel yang ”diam“ (tidak bergerak, statisiones). Sehingga akibatnya
masing-masing komponen dari campuran tersebut akan terbagi (terdistribusi)
secara tidak merata antara alas yang “diam” dan cairan atau gas yang
membawanya. Akibat selanjutnya, masing-masing komponen akan bergerak
(bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential migration) dan dengan
demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut pada waktu yang
berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponen-komponen
yang ada. (Bahti, Husein H. 2011: 4).
Pada
percobaan kali ini yang akan dilakukan adalah penentuan kadar paracetamol dalam
sampel dengan metode HPLC.Paracetamol dalah senyawa yang memiliki sifat polar
dan gugus kromator yang menyebakan senyawa ini dapat menyerap sinar UV.
Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan terkhnik HPLC
menggunakan kolom non polar seperti C-18 dan fasa gerak polar seperti air dan
methanol (Naid,T.dkk,2011:75)
Adapun alat yang digunakan pada
percobaan kali ini adalah gelas kimia,gelas ukur, kertas perkamen, perangkat
HPLC, pipet tetes, sendok tanduk,timbangan analitik,dan spoit sedangkan bahan
yang digunakan pada percobaan kali ini adalah aquades,methanol dan paracetamol.
Cara
kerja pada percobaan ini dimulai dengan
pembuatan sampel pertama-tama disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan ditimbang paracetamol sebanyak 5 mg
dilarutkan dalam 10 ml alkohol (methanol) dan diambil larutan paracetamol
menggunakan spoit secukupnya untuk proses penyiapan innstrumen HPLC dimulai
dengan dikondisikannya instrument HPLC dengan fase gerak dipastikan kabel
penghubung listrik terlah tersembung dengan benar,ditekan tombol “ON” pada alat
berturut-turut untuk power, detektor, dan pompa dilakukan pemprograman alat
dengan computer Dilakukan pemprograman alat untuk computer diikuti langkahnya
sesuai instruksi dari computer , Dipilih mode yang akan digunakan sesuai
parameter kondisi instrument, Apabila kromatogram telah menunjukkan base line
yang mendatar maka instrumen siap digunakan, Diinjeksikan berturut-turut
larutan standar (dimulai dari konsentrasi terendah) dan terakhir larutan sampel,
Dicetak hasil pengukuran dicatat kondisi percobaan, Setelah selesai digunakan
dimatikan pompa dengan menyoroti tanda pompa dalam computer, Ditutup file
sesuai petunjuk lalu dimatikan computer, Untuk mematikan ditekan tombol ”OFF”
pada pompa, detector, dan power secara berurutan diputuskan sambungan listrik.
Hasil
yang diperoleh dari praktikum ini ialah kadar atau nilai paracetamol yang
tertinggi pada waktu 02.29 menit degan kuantitas 28,69 % area, ketinggian 0,3
mau,area 0,1 mAU min dan % areasebesar 28,695 % didapat X= 27,696 sedangkan Cs
hanya 2 %
Alasan
perlakuan pada percobaan ini yaitu digunakan aquades dan methanol dimana kedua
larutan ini memiliki sifat viskositas yang rendah, merupakan cairan jernih,
murni, dan dapat melarutkan cuplikan dimana pada syarat eluen untuk HPLC harus
pelarut yang baik yang baik untuk cuplikan murni, jerni, tidak kental dan
sesuai dengan detektor . Digunakan
sampel paracetamol karna paracetamol
adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromator yang menyebakan
senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan
analisis dengan terkhnik HPLC menggunakan kolom non polar seperti C-18 dan fasa
gerak polar seperti air dan methanol karena paracetamol sangat mudah lart dalam alkohol hal ini
sesuai literature yaitu Farmakope
Indonesia .
Adapun
perbandingan dengan literatur hal ini sesuai dengan literature dimana dalam
farmakope Indonesia IV kadar paracetamol dalam tablet < 70% dan 110%.
Adapun
faktor kesalahan pada prakikum ini kemungkinan paracetamol yang digunakan sudah
kadaluarsa atau terdapat kontaminan dalam sampel, selain itu fase gerak yang
digunakan (aquades dan methanol) tidak murni atau terdapat zat pengotor
sehingga hasil yang diperoleh kurang maksimal.
Hubungan
percobaan ini dengan dunia farmasi yaitu metode HPLC ini sangat populer untuk
menetapkan kadar senyawa obat baik dalam bentuk sediaan maupun dalam bentuk
senyawa hanyati, metode HPLC juga ini sering digunakan karna metode ini memberikan
sensitifitas dan spesifitas yang tinggi.
BAB V
PENUTUP
A.
Kesimpulan
Dari
percobaaan yang dilakuakan dapt disimpulkan bahwa pecobaan HPLC dengan sampel
paracetamol dan fasa gerak berupa aqudes dan methanol diperoleh hasil tertinggi
pada waktu 02.29 menit degan
kuantitas 28,69 % area, ketinggian 0,3 mau,area 0,1 mAU min dan % area sebesar
28,695 %. Selanjutnya dari perhitungan diperoleh a = 1, nilai b = 1 serta nilai
X = 27,696 dari data tersebut diperoleh Cs = 2 %.
B.
Saran
1.
Untuk
Laboratorium
Kami harapkan
agar alat-alat laboratorium dilengkapi
dan washtafel di perbaiki serta bahan-bahan yang akan digunakan lebih bisa
diperbaharui agar praktiku bisa berjalan dengan efektif dan efisien.
2.
Untuk
asisten
Diharapkan
bimbingannya saat praktikum dilakukan agar kita tidak salah dalam melakukan
prosedur dan menggunakan alat alat laboatorium.
DAFTAR
PUSTAKA
Day, R.A., A.L. Underwood. Analisis Kimia Kuantitatif.
Jakarta: Erlangga. 2002
Dirjen
POM. Farmakope Indonesia Edisi III. Jakarta
: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1979
Hendayana, Sumar. Kimia pemisahan Metode Kromatografi dan
Elektroforensis Modern. Bandung : PT. Remaja Rosdakarya. 2006
Petrucci, Ralph H dan seminar. Kimia Dasar. Jilid
1. Jakarta:Erlangga. 1987
Petrucci. Kimia Dasar. Jilid 1. Jakarta: Erlangga.
1996
Sudjadi. Metode Pemisahan. Fakultas Farmasi UGM: Yogyakarta. 1988
Tim Kimia Analitik Instrumen. Penuntun Praktikum Kimia Analitik. 2009
